wb電轉液有沉澱

wb電轉液有沉澱是因蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS濃度，同時將樣品煮沸時間延長；也不排除抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩衝液即可。蛋白質印跡法（免疫印跡試驗），即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行着色。通過分析着色的位置和着色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

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wb一抗為什麼會有沉澱

wb一抗會有沉澱是因為你的蛋白沒有變性完全。反覆用的抗體用久了會產生沉澱，畢竟抗體也是蛋白。至於對於實驗的影響，一般有沉澱了就不建議繼續用了。

做western蛋白煮沸後有沉澱怎麼辦

western

blot樣品煮蛋白後結塊是經常會有現象

如果是

SDS-PAGE

，加了上樣

緩衝液

後依然煮蛋白後結塊，那説明蛋白樣品濃度過高，已經超出了SDS可以結合的濃度。建議降低樣品的濃度即可

如果沒有加含有SDS的上樣緩衝液，那麼就是蛋白樣品被煮沸後變性沉澱了。加入溶解劑即可

wb電泳上樣量大後膠上有藍色

wb電泳上樣量大後膠上有藍色原因是部分樣品未完全溶解有沉澱。沉澱也被溴酚藍染色，故電泳時加樣孔裏會有殘留的藍色。這對做western並沒有影響，可以直接把濃縮膠部分切掉只做分離膠部分的轉膜，那麼殘留的藍色就不會影響到轉膜的效果。

wb轉膜液絮狀物

正常的。wb轉膜液絮狀物是正常的。轉膜時轉膜液要浸沒凝膠和膜,否則也可能出現上述情況。

提純的蛋白出現沉澱影響做western blot嗎

不影響，因為蛋白沉澱可能是因為蛋白濃度過高，導致蛋白聚集，變性，或結構改變引起沉澱，而做WB前要加SDS上樣緩衝液，並煮沸，目標是為了讓蛋白徹底變性，SDS作為一種去污劑，也可以增加蛋白的溶解度，最後離心，會取溶解的部分去上樣的。

而且如果加入loading以後，可能會發現，沉澱反而變少了，就是因為一部分沉澱的蛋白被溶解了。

Western blot 實驗技術及常見問題分析？

Western blot基本原理：

在電場的作用下將電泳分離的多肽從SDS-PAGE凝膠轉移至一種固相支持體，然後用這種多肽的特異抗體來檢測。

Western blot應用：

目的蛋白的表達特性分析；

目的蛋白與其他蛋白的互作；

目的蛋白的組織定位；

目的蛋白的表達量分析；

Western blot一般流程：

蛋白樣品的製備：

1.水溶液提取法：稀鹽和緩衝系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解 度大，是提取蛋白質最常用的的溶劑，操作相對麻煩，重複性一般；

2 有機溶劑提取法；

3 離心管柱提取法：超快速，易用，高產及重複性強；

4 通過層析或電洗脱法制備目的蛋白。

Western blot注意事項和常見問題：

1 我的細胞提取液有的有沉澱，有的很清亮，為什麼呢？

答：有沉澱可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長； 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩衝液即可。

2 我做的蛋白質分子量很小（10 KD），請問怎麼做WB？

答：可以選擇0.2 μm的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。

3最後顯色時用 DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級蛋白，具體可以根據你實驗的情況。

4 要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？

答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western

blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定 量，但是不能定位。

②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品説明一般都會説明可以進行什麼實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

5 細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×106就足夠了。

6 同一樣品能同時提RNA又提蛋白麼？這樣對western blot有無影響？

答：能，沒有問題。

7同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

8 蛋白變性後可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了）。

9 二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知採用這樣的方案後，封閉液是否要作調整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？

答：不能使用脱脂奶粉，因為脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替應該好一點。

10 做組織樣品的western的時候，怎樣處理樣品？

答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性。

11 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬於構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮後的蛋白都含有；構象型表位由於受蛋白空間結構，煮後變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那麼這種抗體可同時用於免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用於免疫組化。

12 在做Western Blot時，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

13 檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

14 蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？

答：這麼廣的分佈不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAGE，濕轉120mA， 45-60min就可以了， 可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。

15 細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什麼原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區別嗎？

答：一般來説提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低温。若有特殊要求可以選擇相應的蛋白酶抑制劑。

16 PVDF膜和膜結合蛋白的原理是什麼？

答：一般而言，纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反覆洗幾次後，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脱落，結果較好。

17 westernblot內參選擇什麼合適？

答：這與目標抗原的表達位置有關，對於胞漿和全細胞蛋白，可選擇內參β-actin、GAPDH和Tubulin；線粒體蛋白則可選擇內參VCDA1/Porin和COXIV；核內抗原可以選擇內參Lamin B1、TBP和histone。

18不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上，轉移效率低？

答：轉移緩衝液中加入20% 甲醇（終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脱效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩衝液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉移效率；使用戊二醛交聯；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉膜電壓/電流，增加轉移時間。

19轉膜時凝膠腫脹或捲曲？

答：可將凝膠在轉膜前放到轉膜緩衝液中浸泡5-10min。

20跑膠的條帶歪斜或者漂移？

答：電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致，可更換或者在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。

21轉膜後膜上有單個或多個白點？

答：轉膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。

22轉膜緩衝液過熱？

答：緩衝液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉膜過程中注意降温。

23顯影后膠片背景太高？

答：轉膜前PVDF膜沒有用100%甲醇完全浸濕；洗膜不充分，可以增加膜洗滌次數；封閉不完全，選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗濃度過高，降低二抗濃度；一抗特異性不強，換用特異性較強的單株抗體；曝光時間過長，減少曝光時間。

24結果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？

答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上樣量，設置已知標準量蛋白的對照；抗體稀釋比例太低，孵育時間不夠；轉膜不好，轉膜後可先用麗春紅染色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當，效價降低。

25目的條帶位置偏低或者偏高？

答：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。

26有非特異性條帶？

答：目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單株抗體；二抗非特異性引起的結果，可設立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異性結合；樣品蛋白質可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當的蛋白酶抑制劑，避免樣品反覆凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的濃度。

27膠片是一片空白，是怎麼回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那麼問題多半出現在一抗和抗原製備上。 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；ECM底物中H2O2，不穩定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應位置；二抗失活。

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目的條帶是白色，周圍有背景？

答：目的蛋白含量太高；一抗濃度偏高，二抗上HRP催化活力太強。

WB實驗問題總結（Western blot蛋白質印跡）

答：原因有很多：

a) 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞；

b) 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMSF，抑制蛋白酶活性；

c) 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看説明，看是否有問題。

答：a) 有沉澱可能因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長；

b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩衝液即可。

答：可以選擇0.2μml的膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其他按步驟即可。

答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。 

答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處於一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。

答：如果能夠排除下面的幾個問題那麼問題多半出現在一抗和抗原製備上。

a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不穩定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；

d) 二抗失活。

是什麼原因呢?

答：a) 可能是紅燈造成的, 膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善；

b) 顯影時間過長。

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體；

b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

答：可能是：

a)樣品濃度過低；

b)轉移時間不夠。

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

13. 要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？

答：① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。

② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品説明一般都會説明可以進行什麼實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

︶ 條帶呈笑臉狀

原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好; 電泳系統温度偏高。

︵ 條帶呈皺眉狀

原因：可能是由於裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。

拖尾

原因：樣品溶解不好。

紋理（縱向條紋）

原因：樣品中含有不溶性顆粒。

條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

條帶兩邊擴散

原因：加樣量過多。

膜封閉不夠

延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。

一抗稀釋度不適宜

對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。

一抗孵育的温度偏高

建議4℃結合過夜。

選擇的膜容易產生高背景

一般纖維素膜的背景會比PVDF膜低。

膜在實驗過程中幹過

實驗過程中要注意保持膜的濕潤。

檢測時曝光時間過長

減少曝光時間。

目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙酰化位點等），本身可以呈現多條帶。

查閲文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。

目的蛋白有其它剪切本

查閲文獻或生物信息學分析可能性。

樣本處理過程中目的蛋白髮生降解

加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。

上樣量過高，太敏感

適當減少上樣量。

一抗特異性不高

重新選擇或製備高特異性的抗體。

一抗不純

純化抗體

一抗或者二抗濃度偏高

降低抗體濃度。

可能的原因及建議

檢測樣本不表達目的蛋白

選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用於確定檢測樣本是否為陰性。

檢測樣本低表達目的蛋白

提高上樣量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。

轉移不完全或過轉移

可以用麗春紅染膜並結合染膠（考馬斯亮藍）後確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。

抗體不能識別測試種屬的相關蛋白

購買抗體前應當認真閲讀抗體説明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。

一抗孵育時間不足

建議4℃結合過夜。

二抗與一抗不匹配

選擇針對一抗來源的種屬的抗體。

洗膜過度

洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑Tween-20。

膜上多處出現黑點或黑斑

原因：抗體與封閉試劑發生非特異性的結合。

反白（條帶顯白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高。

蛋白分子量偏低或偏高

原因：膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。

操作有毒試劑時，帶手套和口罩，且操作揮發性試劑應在通風櫥中進行。

引起電泳塗料沉澱有哪些原因

1、同性或異性雜質離子的進入勢必與電泳漆帶電樹脂發生反應而形成一些絡合物或沉澱物，這些物質的形成就破壞了電泳漆原有的電泳特性和穩定性。對電泳塗裝的前處理質量應嚴格把關。這不僅對提高產品塗裝質量是必要的，而且對維護電泳漆液的穩定性也是極為重要的。純水的水質和磷化液的選擇也是何等的重要。

2、溶劑為了使電泳塗料有良好的分散性和水溶性，塗料原漆中往往含有一定比例的有機溶劑。在正常生產時，有機溶劑的消耗隨着補漆工作的進行而得到了及時補充。但如果生產不正常或温度過高造成溶劑消耗（揮發）過快又得不到及時補充、至使其含量降低至下限以下時，工作漆液亦會發生變化，它使塗膜變薄，嚴重時，還會使漆液中樹脂凝聚或沉澱。因此，在槽液管理過程中，應隨時注意電泳漆液中溶劑含量的變化，必要時，進行溶劑含量分析，及時補加相應數量的溶劑。

3、槽液温度

電泳塗料對温度也有一個適應範圍。温度的升高或降低會加快或減慢電沉積過程，使塗膜增厚或變薄。如電泳漆液温升得過高，溶劑揮發過快，容易造成漆液凝聚沉澱。為了使漆温始終處於一個相對的温度，需配備一台電泳冷熱恆温機。

4、固體份漆液的固體份含量不僅影響產品塗裝質量，而且也是影響漆液穩定性的一個因素。如漆液固體份過低，則其粘性降低，這就促使了漆液的沉澱。當然，過高的固體分也不足取，因為過高，塗件泳後夾帶增多，流失增加，降低塗料利用率，使成本增加。

5、循環攪拌在生產過程中，管理人員必須隨時注意電泳漆液的循環攪拌是否良好，一些儀表壓力（如過濾器、超濾器）是否正常。保證漆液每小時循環4-6次，底部漆液流速是液麪漆液流速的2倍左右，不要使電泳槽形成攪拌死角。非特殊情況，不要停止攪拌。

電泳與沉澱問題!

帶電膠體電泳後不會產生沉澱

膠體是以分散質體子大小為特徵的，它只是物質的一種存在形式，如NaCl溶於水形成溶液，如果分散在酒精中則可形成膠體。

膠體種類很多，按照分散劑的不同，可分為液溶膠、氣溶膠和固溶膠。分散劑是液體的，叫做液溶膠，如Fe(OH)3、AgI膠體；分散劑是氣體的，叫做氣溶膠，如霧、雲、煙等；分散劑是固體的，叫做固溶膠，如煙水晶、有色玻璃等。

電泳現象：

膠粒在外加直流電場的作用下，膠體粒子在分散劑裏向陰極或陽極作定向移動，此現象表明膠粒帶電荷（膠體呈電中性）。

膠體的聚沉：

膠粒在一定條件下相互結合成大顆粒而沉澱的過程，方法有：

（1）加入電解質

（2）加熱

（3）加入與膠粒帶相反電荷的膠體

western blot電泳液和轉膜液的配方在哪裏可以購買

這個配方不用購買了，一般公司的目錄上有的。象寶生物目錄上比較全。或者在網上找一找。又不是什麼專利配方。如果用量少，可以買現成的，如果用量大，當然是買來原料自己配了。

5×Tris-甘氨酸電泳緩衝夜 配製量：1升

所用試劑：Tris鹼，甘氨酸和 SDS

配方： 15.1 Tris鹼

94g 甘氨酸

50ml 10％ SDS

或5g SDS

用900ml水充分溶解後，pH值約為8.4，用少量濃鹽酸（約2.5ml）調至pH8.3，定容至1升，室温貯存備用。

使用時，直接用雙蒸水稀釋五倍（100ml緩衝液+400ml雙蒸水,混勻，常温保存）。一般此電泳液可反覆使用三到五次，如果發現有明顯沉澱或者漂浮時，請丟棄換新的。

10×電轉液 (1L)

所需試劑 ： Tris，甘氨酸和SDS

配方： 30.3g Tris

144g 甘氨酸

3.7 g SDS (如有必要可加)。

用800ml蒸餾水溶解後定容至1L。分裝室温儲存。

參考資料：http://www.biohao.com/shownews.asp?id=347