設計引物的方法和原則

什麼是引物設計原則，一起來看看小編今天的分享吧。

1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大於38bp。

2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。

3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3’的下降形狀也有利於引物與模板的結合。

4、ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利於正確引發反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少於20%，-10時接近於0。

5、錯配率一般不要超過100，否則會出現非目的條帶。但對於某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為340以上，而在錯誤位點的引發效率為110，並且不好找到其他更合適的引物，那麼這對引物是可以接受的。

6、Frq曲線為Oligo6軟體新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重複機率大小，選取引物時，應該用Frq值相對較低的片段。

7、引物二聚體及髮卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR不能正常發生。

8、3'端最好不要是連續鹼基，GGG或CCC會導致錯誤的引發，同時3'端最後一個鹼基最好不要是A或T，若是，會導致錯配。

9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5計算Tm值，也就是退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃範圍內。

10、模板與穩定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高。因為解鏈溫度也取決於它的長度，如果期待的產物長度等於或小於500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產物長5kb，則用24bp的引物。

11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩定（GC含量多），而3'端不穩定（AT含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應。

12、引物和產物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度範圍內最好。

13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據需要新增保護鹼基。